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簡(jiǎn)要描述:Lumafluor公司Red Retrobeads™ 代購現貨,RetroBeads™逆向示蹤熒光微粒是Lumafluor 公司*的逆向示蹤產(chǎn)品,且是目前*證實(shí)有效的示蹤微粒
Lumafluor公司Red Retrobeads™ 代購現貨
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螞蟻淘:4000-520-616
RetroBeads™逆向示蹤熒光微粒是Lumafluor 公司*的逆向示蹤產(chǎn)品,且是目前*證實(shí)有效的示蹤微粒(該產(chǎn)品的有效性經(jīng)數百篇從無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物實(shí)驗的研究論文證實(shí)),目前Lumafluor 公司的綠色和紅色熒光示蹤微粒產(chǎn)品只能從本公司采購。
該示蹤產(chǎn)品體內注射高度集中不易擴散,信號強,對活細胞或活體無(wú)毒,且存留時(shí)間大于一年,與大多順向示蹤劑、原位雜交檢測技術(shù)、免疫組化技術(shù)兼容。
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Lumafluor高效RetroBeads操作說(shuō)明
一、包裝與稀釋?zhuān)?/span>
Lumafluor 的beads包裝于一支密封的小瓶?jì)?,內含的濃縮beads懸浮于蒸餾水中。如使用紅色Beads作為神經(jīng)通路的逆向示蹤,其稀釋方法推薦采用:大鼠視皮層內可采用1:4比例進(jìn)行稀釋而不減少Beads的熒光標記強度和質(zhì)量。然而對于*實(shí)驗我們不推薦使用稀釋的Beads而使用原液進(jìn)行注射示蹤。除蒸餾水外,常規的鹽溶液如NaCl、KCl溶液也可作為稀釋液。如使用綠色Beads,則強烈建議使用原液,無(wú)需稀釋。
二、儲存:
為避免蒸發(fā),Bead溶液應存放于冰箱內4度冷藏,切忌勿冷凍! 冷凍的Beads將失去效用,無(wú)法使用。而變干的beads同樣也無(wú)法使用(無(wú)法重懸),該產(chǎn)品并無(wú)明顯的使用期限,如按要求存放可保存數年。
三、注射:
Beads使用壓力注射,如1 mlHamilton微量注射器或氣壓注射系統,如需小區域微量注射(30-50 nl),可采用末端30-50 um直徑的玻璃電極注射,而常規的逆向示蹤(注射量0.1-0.3 ul)可使用更大直徑的玻璃電極。盡管如此,即使注入更大的劑量,Beads,也不會(huì )明顯從注射位點(diǎn)擴散(通常擴散距離少于1mm),因此,為盡量*標記投射到一個(gè)較大神經(jīng)核團的神經(jīng)元,需使用多點(diǎn)注射。盡管Beads帶有負電荷,但是不建議采用離子滲透法注入示蹤Beads。
四、存活時(shí)間:
在大多數恒溫脊椎動(dòng)物系統中,檢測Beads的zui短有效時(shí)間是24小時(shí),在48小時(shí)內標記強度隨著(zhù)體內注射時(shí)間而延長(cháng),48小時(shí)以后熒光強度基本保持恒定。而在冷血動(dòng)物中,檢測Beads的時(shí)間推薦為1周。目前并未檢測Beads的zui長(cháng)可檢測期,然而在Beads的熒光強度和質(zhì)量至少可保持在體內14個(gè)月以上不變,而細胞可能會(huì )被*標記。目前并未發(fā)現Beads在動(dòng)物或神經(jīng)元中表現出毒性作用的報道。
五、固定和處理:
標準的固定方法是:0.1 M PBS沖洗或灌注后在4%的多聚甲醛(0.1 M PBS配制,pH 7.4)中固定,用戊二醛固定會(huì )產(chǎn)生大量的組織自發(fā)熒光,妨礙Beads標記的神經(jīng)元,并且綠色Beads在戊二醛固定的組織中將*觀(guān)察不到,因此應盡量避免采用。如采用冰凍切片,切片應用PBS漂洗后用明膠包被的載玻片貼片晾干,在*風(fēng)干后,再用二甲苯透明1分鐘,然后用熒光封片劑(Fluoromount或Krystalon)封片。Fluoromount可從Atomergic Chemetals Corp., (Farmingdale, NY)公司購買(mǎi); Krystalon可從
Harleco (EM Industries,Gibbstown, NJ)購買(mǎi)。切片只可短期暴露在乙醇或二甲苯中,但是長(cháng)時(shí)間暴露(大于5分鐘)會(huì )損壞Beads。Beads 對甘油非常敏感,在甘油環(huán)境中熒光會(huì )迅速萃滅,因此切忌使用甘油類(lèi)封片劑,如無(wú)法避免,還可采用水楊酸甲酯代替甘油作為封片劑。封片后的切片如存放于黑暗環(huán)境中,熒光Beads標記的細胞可保持一年不萃滅(但是切片的自身熒光背景會(huì )增加)。迄今為止,還沒(méi)有成功采用塑膠材料包被Beads標記的組織的記錄。
紅色Beads中的染料為羅丹明,因此所有與羅丹明匹配的熒光濾鏡均可使用,部分老的尼康公司的羅丹明濾鏡因背景較高,可能導致無(wú)法觀(guān)察到熒光Beads,通常Zeiss 和Leitz的標準羅丹明濾鏡可獲得較好的觀(guān)察效果。而大多綠色熒光濾鏡均可較好地觀(guān)察綠色Beads的熒光結果,設置為熒光黃的濾鏡可獲得較強的明亮熒光,但是同時(shí)也帶來(lái)較高的背景干擾。較寬波段的熒光濾鏡比窄波段的熒光濾鏡可以獲得更強的熒光信號。在長(cháng)時(shí)間的觀(guān)察和拍照下Beads的熒光也不會(huì )淬滅。
在低倍數或低數值孔徑物鏡下(如 X4, X10)通常難以觀(guān)察到Bads的熒光信號,只有細胞被顯著(zhù)標記,X10的油鏡(數值孔徑大于0.4)或者更大倍數的物鏡才可觀(guān)察到。通常情況下,X 25的油鏡可以清晰地觀(guān)察到低倍鏡下無(wú)法觀(guān)察到的標記細胞。物鏡的選用對綠色熒光Beads尤其重要。在做出實(shí)驗失敗的決定前(在目標區域無(wú)法觀(guān)察到標記細胞),可先用油鏡仔細觀(guān)察注射位點(diǎn)附近的細胞是否被標記,此處應該觀(guān)察到大量的標記細胞。
對使用綠色熒光Beads標記的額外提醒:目前已發(fā)現綠色熒光Beads在年青動(dòng)物比年老動(dòng)物中標記更為理想的情況,此外,年青動(dòng)物的組織自發(fā)熒光(背景)也更低,因此,假如可以的話(huà),在使用綠色熒光Beads做逆向標記實(shí)驗時(shí)請盡量使用年輕動(dòng)物。
因為綠色熒光Beads的激發(fā)光段比紅色熒光Beads短,因此組織自發(fā)熒光是個(gè)麻煩,因此,應采用減少自發(fā)熒光的步驟以獲得更理想的實(shí)驗結果,這些方法有:(1)使用更薄的切片,如30微米比40或50微米理想;(2)使用年青的動(dòng)物;(3)封片后立即觀(guān)察拍照(隨著(zhù)時(shí)間增加背景也會(huì )增加)。
對使用色熒光Beads標記的額外提醒:目前已發(fā)現綠色熒光Beads在年青動(dòng)物比年老動(dòng)物中標記更為理想的情況,此外,年青動(dòng)物的組織自發(fā)熒光(背景)也更低,因此,假如可以的話(huà),在使用綠色熒光Beads做逆向標記實(shí)驗時(shí)請盡量使用年輕動(dòng)物。
因為綠色熒光Beads的激發(fā)光段比紅色熒光Beads短,因此組織自發(fā)熒光是個(gè)麻煩,因此,應采用減少自發(fā)熒光的步驟以獲得更理想的實(shí)驗結果,這些方法有:(1)使用更薄的切片,如30微米比40或50微米理想;(2)使用年青的動(dòng)物;(3)封片后立即觀(guān)察拍照(隨著(zhù)時(shí)間增加背景也會(huì )增加)。
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